لینک پرداخت و دانلود *پایین مطلب*
فرمت فایل:Word (قابل ویرایش و آماده پرینت)
تعداد صفحه: 127
فصل اول
مقدمه:
روشهای سنتی اصلاح نباتات مبتنی بر دستکاری ساختار ژنتیکی گیاه کامل و از طریق تولید جنسی است. در سالهای اخیر روشی برای دستکاری ژنتیکی در سطح سلولی پیدا شده است که روشهای اصلاحی را بطور منحصر بفرد کامل می کند. موجودیت پیدا کردن روشهای کشت بافت و سلول را می توان به پیشرفتهای ناشی از دانش کشت سلولی و زیست شناسی مولکولی دانست (4 و 51)
بیوتکنولوژی یا فناوری زیستی مجموعه ای از فنون را تشکیل می دهد که امکان بکارگیری، توانایی و کارآیی سلولهای موجودات زنده اعم از حیوانی یا گیاهی را فراهم می سازد. در سالهای اخیر با انجام تحقیقات متعدد در حوزة بیوتکنولوژی کشاورزی این بخش دارای جایگاه مهم و باارزشی شده است و این امکان را در رابطه با گیاهان زراعی فراهم نموده است که بسیار مطالب کارآتر از روشهای کلاسیک اصلاح نباتات با استفاده از تکنیکهای مختلف از قبیل دست ورزی ژنتیکی (Genetic manipulation)، کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro و غیره، گیاهانی با سازگاری متناسب تر و بیشتر به شرایط محیطی و همچنین سازگار با نیاز انسانها تولید نماید.
تکنیک کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro ازجمله فنون بیوتکنولوژی است که کاربرد آن به اوایل سالهای 1950 می رسد. بر اساس این تکنیک، سلول گیاهی یا بافت از اندامهایی مثل ریشه، ساقه، برگ و گل آذین یا هر اندام دیگری از گیاه جدا شده و در شرایط کاملاً استریل و گندزدایی شده، در درون لوله های آزمایش محتوی محیط غذایی مصنوعی قرار گرفته و با تأمین نیازهای نوری و حرارتی مناسب تبدیل به یک گیاه کامل می گردد. این تکنیک همانطور که اشاره شد امکان تولید هزاران گیاهچه مشابه گیاه مادری را در مدت زمان بسیار کوتاهی و در فضای فیزیکی بسیار محدودی فراهم می‌سازد که با انتقال این گیاهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه تولید انبوهی از گیاهان مورد نظر را می توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تکنیک کشت بافت و نیز تولید کالوس یا گیاهچه ها در مقیاس وسیع و انجام گزینش در بین نمونه ها می توان از ارقام مقاوم به استرسهای محیطی را تولید نمود. فنون فوق فرصتهای مناسبی در بخشهای مختلف تحقیقاتی، اقتصادی بوجود آورده است که با تقویت بخش دولتی و فعال نمودن بخش خصوصی کارایی این بخشها را برای تأمین و تولید محصولات اساسی کشور را، بطور قابل ملاحظه ای می توان افزایش داد. (51 و 98)
تاریخچه اهمیت کشت بافت:
مفهوم کشت بافت گیاهی خلاصه عبارت کشت پروتوپلاست گیاهی، سلول گیاهی، بافت و کشت اندام گیاهی است. کشت بافت و سلول گیاهی بر اساس نظریة شوان مبنی بر دارا بودن خاصیت توتی پوتنسی سلولها پایه گذاری شد. توتی پوتنسی خاصیتی است که بر اساس آن یک سلول دارای توان تبدیل شدن به موجود کامل است. در سالهای اخیر، تکنیک کشت بافت گیاهی به یک ابزار بسیار قدرتمند برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی تبدیل گشته است. این تکنیک با ابراز نظریة گوتلیب هابرلاندت در مورد خاصیت توتی‌پوتنسی در سلول گیاهی در آغاز قرن بیستم آغاز گردید. هارلاند پیشنهاد نمود که روشهای جداسازی و کشت اندام گیاهی باید توسعه یابد و ادعا نمود که اگر محیط و مواد غذایی سلولهای کشت شده، دستورزی شده باشند، آن سلولها باید صفات ارثی مربوط به مراحل رشد و نموی گیاه اولیه را تکرار نمایمد. دیدگاه هابرلاند در حقیقت قابل توجه بود زیرا وی حتی بیان داشت که خارج از سلولهای سوماتیکی زنده، جنینهای مصنوعی به صورت غیر جنسی رشد و نمو می یابند.(5) احتمالاً وایت نخستین کسی بود در سال 1954 مسئله کشت سلولی را به روشنی بیان کرد. او بیان داشت که تفاوتهای بین سلولهای دیگر در آن ارگانیسم می باشد. لذا امکان دارد بتوان با جدا نمودن سلول، پتانسیل نهفته توتی پوتنت را به آنها بازگردانید. البته احتمال دارد که این خاصیت در سلول برای همیشه از دست رفته باشد. اسکوگ و میلر در 1957 پیشنهاد نمودند که اثرات متقابل کمی بین اکسین و سیتوکینین نوع رشد و مراحل مورفولوژیک را که باید در گیاه رخ دهد، تعیین می کنند. مطالعات آنها در توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکسین باعث القای رشد ریشه می شود؛ درحالیکه نسبت بالای سیتوکسین به اکسین باعث القای رشد ساقه میگردد، هرچند که این الگو پاسخ کلی و عمومی نیست. (1 و 5 و 9 و 98)
دستورزی نسبت اکسین به سیتوکینین در بسیاری از گونه ها و جنسها برای ریخت زایی موفقیت آمیز بوده است. کارهایی که توسط مورل[1] (1960) روی ازدیاد ارکیده انجام گردیده است، آغازی برای کاربرد تکنیک کشت بافت گیاهی برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی بود که منجر به توسعه و گسترش استفاده از محیطهای کشت جدید با غلظتهای بالای نمک توسط موراشیگ و اسکوک[2] گردید.
در سال 1966 نیز گوها[3] و محشوری[4] امکان ایجاد تعداد زیادی از گیاهچه هاپلوئید از دانه داتوره بوسیله کشت بساکهای نابالغ را ثابت کردند. (98)
در سال 1970 اولین امتزاج موفقیت امیز پروتوپلاست در محیط کشت تحقق یافت. در همین سال انتخاب موتانهای بیوشیمیایی در شرایط آزمایشگاهی صورت گرفت. در 1974 تولید گیاهان هیبرید حاصل از امتزاج پروتوپلاستهای هاپلوئید به نتیجه رسید. (1 و 98)
تحقیقات در زمینه کشت بافت گیاهی از سال 1975 به بعد بطور چشمگیری افزایش یافت و از دهة 1980 به بعد به عنوان بخش مهمی از بیوتکنولوژی گیاهی مورد توجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته است بطوریکه در سال 1977 توسط چلتون و همکاران ادغام موفقیت آمیز DNA پلاسمید Ti از Agrobacteriam tumefaciens به گیاهان صورت گرفت. (98 و 100)
در حال حاضر کشت بافت به عنوان پیش نیاز مهندسی ژنتیک از اهمیت ویژه ای برخوردار است. از طرفی کشت بافت بعنوان مکمل روشهای کلاسیک متداول در اصلاح نباتات بکار می رود نه جایگزین آن (86 و 100)
اساس گیاه شناسی برای کشت بافت:
ظرفیت طبیعی گیاهان به منظور تکثیر توسط فرآیندهای غیرجنسی، اساس تکثیر در تکنیک کشت بافت است. کشت بافت به سادگی به ما کمک می کند تا از پتانسیل طبیعی موجود در گیاه برای رشد و تکثیر استفاده کنیم که البته تکنیکی بسیار کارآمد و قابل پیش بینی است (62 و 96)
اهداف مورد نیاز با استفاده از تکنولوژیهای جدید کشت بافت و مهندسی ژنتیک:
- تکثیر سریع گیاهان جهت استفاده در تحقیقات اصلاحی ژنتیکی.
- تولید گیاهان هاپلوئید و دای هاپلوئید
- ایجاد هیبریداسیون سوماتیکی بین گونه ای و بین جنسی
- ایجاد موتاسیونهای القایی
- حفظ و نگهداری منابع گیاهی از طریق کشت بافت
- انتقال ژنهای خارجی مطلوب به سلولهای مورد نیاز از طریق کشت بافت و مهندسی ژنتیک
- تولید گیاهان عاری از ویروس
- ایجاد لاینهای مقاوم به امراض و بیماریها
- ایجاد لاینهای مقاوم به شوری و خشکی
- تهیه لاینهای مقاوم به علف کشها
فصل دوم
خصوصیات زراعی
تاریخچه: طبق نظر واویلوف دانشمند روسی، مبدأ یونجه مرکز خاور نزدیک آسیای صغیر، قفقاز ایران و مناطق کوهستان روسیه است. مرکز جغرافیائی یونجه را غالباً کشور ایران می دانند. باید گفت که یونجه مدتها پیش از زمانی که از آن در تاریخ ذکری به میان آمده است، کشت می شد و هم اکنون نیز بطور وحشی در اکثر نقاط دنیا رشد می یابد. مطالعات خانم سینکایا (sinskaya) نشان می دهد که یونجه از لحاظ مبدأ دارای دو مرکز است. نخستین مرکز آن ناحیه کوهستانی قفقاز بود که ارقام جدید یونجه های اروپائی از آن بدست آمده است. دومین مرکز مستقل پیدایش را آسیای مرکزی می دانند. تاریخچه یونجه، سرگذشت مهمترین گیاه علوفه ای دنیا و اولین گیاه علوفه ای اهلی شده است که بشر اولیه اهمیت و ارزش آن را بعنوان غذای دام تشخیص داده است. از نظر تکاملی، توجه به کشت یونجه بطور چشمگیری موفقیت آمیز بوده است که علت این امر شاید وجود سیستم ریشه ای مناسب آن است که طی قرون متمادی و تکامل همزیستی باکتری ریزوبیوم و ریشه یونجه، گیاه یونجه به یک منبع ازت سرشاری دست یافته است که نیاز این گیاه به این عنصر غذایی را مرتفع می نماید. از طرفی ریشه یونجه بعلت عمیق و راست بودن، توانایی کافی در جذب رطوبت از اعماق خاک را داراست که گیاه را در شرایط خشکی از خطر نجات می دهد. همچنین گیاه یونجه در اثر خشکی و سرما به حالت رکود و خواب رفته و بعد از وجود شرایط مناسب به رشد خود ادامه خواهد داد. ساقه های خزنده یونجه (stolon) و ریشه های خزنده زیرزمینی (Rizom) و طوقه به خاک نشسته یونجه مقاومت گیاه را در مقابل سرما و یخبندان افزایش می دهد. (6 و 62)
اهمیت اقتصادی:
غذای دامهای نشخوار کننده، سیستم پیچیده ای را در دنیا از تظر تولید غذائی به نمایش می‌گذارد. 75 درصد غذای تولید شده دنیا را حیوانات نشخوارکننده مصرف می کنند.
80-60 درصد غذای حیوانات نشخوارکننده را علوفه تامین می نماید. 18 درصد غذای بشر و 36 درصد از پروتئین مصرفی انسان را علوفه تامین می کنند و از این لحاظ بهترین وسیله برای تقویت غذائی بشر می باشد. یونجه گیاهی است که بیشترین تولید در میان علوفه ها را در دنیا به خود اختصاص داده است. در دنیا یونجه بعنوان غذای دام بطور مستقیم بصورت چراگاه و یا در دامداریهای صنعتی مورد استفاده قرار می گیرد و بعنوان منبع هیدرات کربن و پروتئین دام مورد استفاده قرار می گیرد.
کشور ایران دارای 20 میلیون هکتار زمین قابل کشت است که سالیانه حدود 10 میلیون هکتار به حال آیش گذاشته می شود و حدود 5/8 تا 9 میلیون هکتار به زیر کشت می رود. 6/5 میلیون هکتار به کشت گندم و بقیه به سایر محصولات شتوی و صیفی اختصاص دارد که 284936 هکتار آن را یونجه تشکیل می دهد. (6 و 64)
گیاه شناسی یونجه:
گیاهی است چند ساله دارای ریشه ای راست و مستقیم که به نام ریشه اولیه یونجه معروف است. این ریشه بعد از قرار گرفتن بذر در خاک و جذب رطوبت، بدون انشعاب است. به موازات تشکیل این ریشه قسمت زیر لپه یا هیپوکوتیل در زیر سطح خاک نمودار می شود. و با طویل شدن آن باعث جوانه زدن و خارج شدن از سطح خاک می شود که در این مرحله گیاهی است حساس نسبت به کمبود آب، افزایش بیش از حد آب، شوری خاک و سله بستن. وقتی زیر لپه یونجه از سطح حاک نمودار گردد، در این موقع یونجه جوانه زده فقط دارای دو لپه یا کوتیلدون است که بصورت برگهای متورم به نظر می آیند و بعد از مدتی از بین رفته و برگهای اصلی از مرکز آن بوجود می آیند که دارای دمبرگی طول می باشند که معمولاً قلبی شکل بوده و شباهتی به برگهای اصلی یونجه ندارد. که بعد از طی زمان نخستین برگ مرکب 3 برگچه ای نمایان می شود.
علاوه بر ریشه اصلی، ریشه های جانبی نیز از سلولهای حاشیه استوانه مرکزی ریشه اصلی نمودار می شود. که عامل موفقیت یونجه در مقابل عوامل نامساعد وجود سیستم مناسب ریشه می باشد. بعد از کشت چند هفته از رشد و نمو گیاه و وجود رابطه همزیستی ریشه گیاه با باکتریهای ریزوبیوم یونجه دیگری نیازی به ازت خاک ندارد. علاوه بر آن ریشه عمیق و راست یونجه موجب حذب رطوبت از اعماق تا 5 متر نیز می شود. که امتیاز باارزشی در مقاومت به خشکی است. ساقه های خزنده روی زمین (استولون)، ریشه های خزنده زیرزمینی (ریزوم) از قسمتهایی هستند که در طول مدت رشد و نمو این گیاه به وجود می آیند.
ساقه اصلی یونجه چهارگوش به نظر می رسد و مغز آن از سلول های پارانشیمی نسبتاً بلند و فشرده پر شده است و دارای انشعابات بسیار زیاد و ظریفی است که هر کدام برگهای مرکب زیاد دارد. ساقه یونجه در نزدیک سطح خاک، انشعابات زیادی تولید کرده که به مرور زمان چوبی و ضخیم می‌شود و به طوقه تبدیل می گردد. که از این محل ساقه های کوتاه منشعب و ضخیم بوجود می آید که تبدیل به ساقه های بلند و اصلی یونجه می شود. تعداد ساقه ها بین 5 تا 40 عدد است که از ناحیه طوقه خارج می شود و از هر ساقه بعد از چیدن یا رسیدن، ساقه دیگری تولید می شود. بعد از گذشت چند سال طوقه بصورت توده انبوهی درمی آید که در داخل خاک و یا خارج از خاک قرار می گیرد. ساقه های هوائی راست، سبزرنگ و پوشیده از کرک های نرم است. ارتفاع این ساقه ها در ارقام مختلف، در برداشت های مختلف، در مناطق گوناگون و در خاکها، با یکدیگر متفاوت است.
برگ های یونجه مرکب، رنگ برگچه های یونجه سبز تیره، تخم مرغی، سطح زیرینشان پوشیده از کرک است. برگچه و سطح برگ مرکب یک دمبرگچه کوتاه دارد ولی برگچه های جانبی فاقد دمبرگچه می باشند. در قاعده دمبرگ دو گوشوارک یا استیپول وجود دارد که به دمبرگ متصل هستند، هر کدام زائده ای باریک و بلند در انتها و نیز دندانه هائی ظریف و کوچک در قاعده دارد. برگچه های یونجه کشیده، طویل و تقریباً در انتهای آن مضرس است. برگچه ها دارای یک رگبرگ اصلی یا رگبرگچه هستند که تا راس برگچه امتداد می یابد و از این رگبرگچه اصلی، رگبرگچه های فرعی منشعب می شود.
گل یونجه دارای خصوصیات ویژه ای است. رشد و نمو گل یونجه، از انتهای شاخه ها با تغییر حالت از رشد و نمو رویشی به زایشی آغاز می شود. این تغییر حالت در فصل بهار از دهمین تا چهاردهمین گره از طوقه یونجه و در فصا تابستان از ششمین تا دهمین گره صورت می گیرد. بنابراین مفهوم آن این است که یونجه هایی که در بهار به گل می نشینند دارای رشد و نمو زیادتری هستند و ارتفاع ساقه آنها هم بیشتر است ولی یونجه هائی که در تابستان به گل می نشیند ارتفاع کمتری دارند. هر گل دارای یک کاسه، یک جام، ده پرچم و یک مادگی است. کاسه گل شامل پنج کاسبرگ متصل است که به پنج قسمت یا دندانه تقسیم می شود و طول هر قسمت تقریباً برابر طول کاسه است. جام گل شامل 5 گلبرگ به نامهای درفش، بال و ناو به هم پیوسته است. رنگ گل یونجه معمولی شبهی از رنگ ارغوانی یا بنفش است. رنگ گل یونجه داسی مدیکاگو فالکاتا، زرد تیره و رنگ یونجه مدیکاگو لوپولینا، زرد رنگ است. رنگ گل ارقام مختلف گونه های جنس میکاگوممکن است سفید، بنفش، زرد و یا رنگارنگ باشد. مادگی یونجه شامل یک برچه با تخمدان فوقانی، خامه صاف و میان تهی و کلاله مشخص است. تخمک ها بطور متناوب در طول شکاف شکمی تخمدان تشکیل می شوند. معمولاً ده تا دوازده تخمک در تخمدان یونجه رشد می کند، ولی تعدادشان ممکن است بین شش تا هیجده عدد تغییر کند. درون گل یونجه، ده پرچم قرار دارد که نه عدد آنها به هم متصل و دهمین پرچم، نزدیک به درفش آزاد است. میله های پرچم مادگی را احاطه می کنند. (6)
آب و هوا:
گیاه یونجه بهترین رشد را در مناطقی دارد که هوای آن مناطق، خشک، آفتابی، گرم و نیز آب زیادی در دسترس داشته باشد. که در شرایط ایران جلگه خوزستان، دشت مغان و منطقه جیرفت مطلوب به نظر می رسد. بطور کلی در ایران می توان سه منطقه مختلف آب و هوائی را برای رشد و نمو یونجه در نظر گرفت: مناطق خشک، نیمه خشک و مرطوب. مستعدترین مناطق برای رشد و نمو یونجه، در صورت وجود آب کافی مناطق خشک و پس از آن مناطق نیمه خشک و در آخر مناطق مرطوب است.
یونجه در مقابل تغییرات دمای محیط حساس نیست و قادر است دمای 50 تا 60 درجه سانتیگراد زیر صفر و 50 درجه سانتیگراد بالای صفر را تحمل نماید. یونجه با ریشه های عمیقی که دارد می تواند در مناطق نسبتاً خشک و کم آب مقاومت کند.
کشت یونجه در ارتفاعات مختلف انجام می گیرد. از ارتفاع 2465 متری در آبعلی 1644 متری در همدان تا ارتفاع 1000 متری در ابرقو کشت می شود. کشت یونجه در ارتفاع پایین تر مثل ابادان و اهواز (13 متر) و حتی پایین تر از سطح دریای آزاد در رشت، امکان پذیر می باشد.
یونجه در محل های گوناگونی و در خاکهای مختلف رشد و نمو می یابد. در نیم کره شمالی تا نیم کره جنوبی از مناطق کوهستانی تا مناطق جلگه در خاکهای سنگین تر خاکهای سبک و شنی رشد می یابد.
بغیر از مرحله جوانه زدن در سایر مراحل رشد به شوری خاک مقاوم است. در خاکهای آهکی نیز یونجه رشد خوبی می تواند داشته باشد. (6)
کاربرد بیوتکنولوژی در اصلاح یونجه:
چگونه بیوتکنولوژی باید برای توسعه یک برنامه پیشرفته اصلاحی یونجه بکار برده شود تا واریته های بهتر، متناسب برای تحویل در تولید مثل با حداکثر خاصیت هتروزیگوسیتی ایجاد شود، موضوعی است که اخیراً مورد توجه دانشمندان قرار گرفته است. در این مقوله، بهبود نژادهای والدینی و بکارگیری هیبریداسیون می تواند تغییر و تبدیل در واریته را در جهت اهداف مشخصی افزایش دهد. موارد زیر جزو بارزترین راهکارهای بیوتکنولوژی برای بهبود یونجه است (64 و 103 و 104 و 89)
مهندسی ژنتیک:
ژنهای بالقوه برای مهندسی ژنتیک عبارتند از: ژن پروتئینی
Bacillus thuringiensis برای کنترل حشرات بال پولکی، ژنهای پروتئینی پوشش ویروس، ژن مقاومت به علف کش، ژنهای بازدارنده آنزیم (تجزیه کننده) پروتئین برای بهبود کمیت و کیفیت و از بین بردن آنزیمهای هضم کننده پروتئینی قارچی و شکارچی حشرات (Abelson, 1989, Ryan, 1939)، ژنهای پروتئینی بازدارنده آنزیم (تجزیه کننده) پلی گالاکتوز برای جلوگیری از فعالیت endo-polygalacturonase میکرو ارگانیسم های از بین برنده دیواره سلولی (Degra et al 1988)، ژن glutamin-synthetose anti-sense برای افزایش محصول، ژنهای آنزیم کننده، کیتین برای هیدرولیز کردن جلد حشرات تغذیه کننده (Abelson , 1989) و مواردی از قبیل مقاومت به آلومینیوم. ورای سهولت دسترسی، محدودیت عمده در ترکیب ژنهای مورد نظر به درون واریته های تجارتی همان پروسه ای خواهد بود که بوسیله آن واریته های یونجه اصلاح می شوند. واریته های یونجه با ترکیب تعداد زیادی افراد اصلاح شده و واریته ترکیبی را بوجود می آورند. این پروسه سهم ژنتیکی فرد را در جمع به حداقل می رساند.
(103 و 83)
هیبریداسیون گسترده:
تکنیکهای پروتوپلاسم و درآوردن جنین برای هیبریداسیون یونجه های زراعی گونه های یونجه یک ساله Medicago با لگومهای دیگر مثل اسپرس (Onobrychis vicifolia Scop) و شبدر (Lutus corniculatus L.) بکار می رود. یکی از برجسته ترین کارهای این شیوه انتقال مقاومت می باشد (مقاومت به نفخ). (87 و 92)
فصل سوم
کشت بافت
بررسی منابع:
کشت بافت یونجه:
اولین گزارش مربوط به کشت بافت یونجه توسط ساندروز وبینگهام در سال 1972 انتشار یافت. آنها گزارش کردند که کالوس می تواند تخمدان نارس[5]، میان گرهها، هیپوکوتیل[6] و حتی پرچم نارس[7] تولید شود. همچنین همة گیاهان تولید شده دارای کروموزومهای سوماتیکی برابر گیاهان دهنده بودند. بعد از این تحقیق راندمان باززایی رو به پیشرفت گذاشت. آرسیونی و همکاران(1990) تعداد ی از گزارشات کشت بافت یونجه که شامل نوع گونه، کالتیوار، ریزیونجه، محیط کشت القاء کالوس[8] و یا محیط کشت رشد[9]، محیط باززایی و نوع باززایی[10] را گردآوری کردند. (8)
در سال 1972 سانددرز[11] و بینگهام[12] تولید کالوس را در محیط نیمه جامد بررسی کردند. تحقیقات آنها نشان داد که اضافه کردن NAA، تیروزین یا سیتوکینین هرکدام به تنهایی یا به صورت ترکیب، کالوس زایی را افزایش می‌دهد. بهترین تولید که روی محیط بدست آمد شامل مواد غیرآلی و ویتامینها ازجمله 100mg/l اینوزیتول و 2gr/l عصارة مخمر بود. توانایی کالوسهای تازه برای باززایی بستگی به سطوح مختلف هورمونی داشت ولی طول مدت روز در تمایز اثری نشان نداد. از کشت بساکهای بالغ، قسمتهای میان گره، هیپوکوتیل، بذور و تخمک بالغ، کالوس و گیاه باززایی شده بدست آمد.
در واقع آزمایشات دقیق تأثیر هورمونها در سطح القاء کالوس اولین بار توسط دانشمندان فوق بررسی شد، آنها مشاهده کردند که وقتی 2-4-D در محیط آغازیدن وجود نداشت جوانه ای هم تشکیل نشد. بنابراین 2-4-D تنها هورمونی است که مسئول همراهی القاء کالوس و اندامزائیهای بعدی باشد. (89 و 84)
در سال 1987 وان[13]و لیانگ[14] تحقیقی در مورد اثرات کاینتین در کالوسهای یونجه انجام دادند:
محیطهای کالزایی B5، B2K، 17951 برای مطالعات اثرات کینتین مورد استفاده قرار گرفت و مورفولوژی، هیستولوژی و باززایی در یونجه ها بررسی شد. حضور کینتین در القاء کالوسهای ضروری تشخیص داده شد. کالوسهایی که توسط کینتین تولید شده بودند در محیط B5 و 17951 دارای سلولهای متراکم بودند که حاوی ناحیة مریستمی بودند و تمایز بالایی در گیاهچه های حاصل از محیط باززایی نشان دادند. اکثر کالوسهای تولید شده داراری سلولهای تخصصی و ساختمان قابل انعطاف بودند. بعد از انتقال کالوسها به محیط هورمون دار کالوسهای حاصل باززایی شدند. در این آزمایش از دمبرگهای دومین یا سومین برگهای رأس ساقه استفاده شد. (99 و 100)
کالوس را می توان برای مدت زمان طولانی یا کوتاه مدت حفظ کرد. این توانایی اکثراً به ژنوتیپ وابسته است. بعضی وقتها کشتهای طولانی مدت را می توان بوسیلة افزودن سطوح بالای سیتوکینین وادار به جنین زایی کرد. این موضوع بوسیلة استوارک[15] و همکاران گزارش شده است. (8)
مطالعه ای در سال 1985 روی جنین زایی و باززایی یونجه توسط مک کنزی[16] و ناگاجان[17] انجام شد. ده کولتیوار و لاینهای حاصل از دو گونة یونجه M.sative و M.media برای توانایی جنین زایی انتخاب شدند و گیاهچه های حاصل از ریشه و هیپوکوتیل در سه محیط جداگانه کشت شدند. این سه پروتوکول دارای مقادیر متفاوت از نمکها، ویتامینها و هورمونها بودند. پروتوکولی که مقادیر زیادی از 2-4-D و مقدار کمی از سیتوکسین داشت بیشترین کالوس جنین زا را تولید کرد. دولاین اصلاحی M.media که درصد بینابینی از نظر جنین زایی داشت درصد بسیار بالایی از باززایی را داشت. ریشة خزنده M.media بیشترین درصد جنین زایی را تولید کرد.
3- جنین زایی
در سال 2002، Pasternak T.P و همکاران اثرات اکسین و pH را در فعالیت تقسیم سلولهای جنین زا در پروتوپلاست حاصل از برگهای یونجه بررسی کردند. اثرات جنین زایی در مقادیر پایین (M1) و بالای (M10) از 2-4-D تفاوت بود. سلولهای مواجه با میزان بالای 2-4-D دارای سیتوپلاسم متراکم گردید. کوچک باقی ماندند و توانستند به خوشه های سلولهای پیش جنینی تبدیل شوند. در حالی که سلولهای مواجه با 2-4-D پایین طول شدند ولی از بین رفتند یا کلنی تمایز نیافته دادند. در این بررسی ها از محیط m.s استفاده گردید.
در سال 2000، Iantcheva و همکاران میزان تشکیل جنین و باززایی را در محیطهای مایع در گونه های دیپلوئید Medicago شامل برگ و دمبرگ 5 گونة M.ciliaris و M.murex و M.ombicularis و M.polymorpha و M.truncatula بررسی کردند. جنین ها به راحتی در محیط حاوی 1mg/l یا 2-4-D 4mg/l بدست آمدند. آنها از محیط القاء B5 استفاده کردند و از غلظتهای متفاوت 40 و 11 و 4 و 3 و 2 و 1 و 0.4 میلی گرم در لیتر از 2-4-D تکمیل شده با
0.2m/l کاینتین، 1mg/l آدنین و 500mg/l میواینوزیتول استفاده کردند. مشاهده شد که حضور 0.05mg/l و NAA برای بلوغ جنین سوماتیکی لازم است. رشد جنین گلبولی شکل تا رسیدن به مرحلة تورپدو و در محیط B5 با 2-4-D 4mg/l انجام گرفت.
Walker و SATO در سال 1981 مقاله ای تحت عنوان مورفوژنز در کالوسهای Medicago sative و نقش یون آمونیوم در جنین زایی سوماتیکی منتشر کردند. آنها اظهار داشتند که وجود یون آمونیوم چه برای تولید ریشه چه برای جنین زایی سوماتیکی در شرایط In vitro ضروری است. مقدار یون لازم حدود
m12.5 در محیط باززایی بود. بیش از m50 یون آمونیوم به عنوان بازدارنده عمل کرد.
Arcyoni و همکاران در سال 1982 جنین زایی سوماتیکی را توسط کشت سوپانسیون پروتوپلاست و کشت مزوفیل برگ یونجه های M. corulea و M.glutinosa بررسی کردند. شرایط رشد گیاه، سن گیاه و ایزولاسیون پروتوپلاست بررسی شد و نتایج بدست آمده حاکی از آن بود که میزان مناسبی از اکسین و سیتوکسین در جنین زایی در گونه های مختلف M.corulea مؤثر است.
Kao و Myctayiuk (1980) کشت سوسپانسیون را در 9 گیاه یونجه انجام دادند و نتایج نشان داد که شرایط غذایی متفاوت برای جنین زایی مورد نیاز است (ازجمله سطوح مناسب هورمونی و نمکهای معدنی) هفت گیاه از نه گیاه قابل تبدیل به گیاه کامل بودند.
- در سال 1985 Brown و همکاران نقش زمینة ژنتیکی را در جنین زایی سوماتیکی یونجه بررسی کردند. از 76 کولیتوار یونجه متعلق به دو گونه sativa و falcate بدون توجه به پروتوکول، ریز نمونه و محیط های کشت، پاسخ متفاوتی بدست آمد.
در سال 1987 Meyyer و همکاران اثرات نیتروژن و ساکارز را در جنین زایی کلونهای حاصل از M.sativa بررسی کردند. یک نیاز مبرم به آمونیوم برای جنین زایی و تمایز مشاهده شد. اسید آمینه ها نه تنها برای تمایز ضروری تشخیص داده نشدند بلکه به عنوان مهارکننده هم عمل کردند. به جز 1-2g/l کازئین هیدرولیز شده یا 4.4mM گلوتامین با 30mM پرولین که در شرایط خاص 20-30% در افزایش جنین نقش داشت. ساکاروز زیاد یا کم مانع جنین‌زایی بود. کلونهای انتخاب شده از سه کولتیوار از M.sativa یک پاسخ مشابه به باززایی نشان دادند.
4- باززایی
Ray و Bingham در سال 1989 باززائی در یونجه های دیپلوئید را مورد مطالعه قرار دادند. این مطالعات نشان داد باززایی توسط ژنهای محدودی کنترل می شود. Bertnard و همکاران (2001) روش نواری را برای جنین زایی یونجه گزارش کردند و نشان دادند در روشی که برگها همه قطعه قطعه شده و در محلول آنزیمی به همراه مانیتول بجای ساکاروز (به عنوان اسمز نگهدارنده) نتایج کشت پروتوپلاست موفق تر بوده و جنین زایی در B5 موفقیت آمیز بوده است.
تحقیق دیگری توسط علیرضا مطلبی آذر و علی جعفری مفید آبادی (1379) برروی کالزایی، جنین زایی و باززایی در جمعیتهای یونجه ایرانی انجام گرفت. آنها مجموع چهار روش موفق را بررسی کردند روش اول روش مک کوی و واکر بود که در آن از زیر نمونه هیپوکوتیل و محیط کشت پایه SH استفاده کردند. محیط القاء کال شامل
2 2-4-D+5NAA+2Kin محیط القاء جنین شامل11 2-4-D و 1Kin بود. محیط باززایی Boi2y و در محیط بدون هورمون 30 روز تولید باززایی کرد. در روش ونزل و براون از زیر نمونه دمبرگ در محیط کشت MS استفاده شد. محیط القاء کال شامل 2Kin+5 2-4-D محیط القاء جنین شامل 5 2-4-D+2Kin و محیط باززایی MS بود. محیط القاء کال 2 2-4-D و 0.25Kin در محیط القاء جنین شامل 10 2-4-D و 1Kin محیط باززایی MS بدون هورمون بود. در روش آرسیونی و همکاران از ریزنمونه لپه استفاده شد و محیط کشت پایه MS، محیط القاء کال 2 2-4-D و 0.25Kin و محیط القاء جنین 0.25Kin و 2 2-4-D و محیط باززایی MS بدون هورمون بود. هر چهار روش پاسخ مناسبی در بر داشتند.
در سال 1984 آقای میتن (73) و همکارانش بررسی 35 کالیتوار یونجه را آغاز نمودند. در این آزمایشات تقریباً از هر یک از کولتیوار تعداد 20 ژنوتیپ انتخاب گردید و بدور آنها استریل شده و در محیط آگار کشت داده شدند. سپس هیپوکوتیل بذور جوانه زده را در محیط کشت SHNAAK کشت نمودند. بافت کالوس در هفته های ششم تا هشتم بوجود می آید. وقتی حداقل 2 گرم کالوس ایجاد شد آزمایش باززائی با روش Qalker و Sato آغاز می شود. کالوس های هر ژنوتیپ با هم مخلوط نموده و 10 نمونه 150 میلی گرمی از هر کدام در محیط کشت SH حاوی 50 میکرومول 2-4-D و 5 میکرومول کینینن است، کشت می گردد. بعد از 3 روز بافت را به محیط بلایدس[18] جاوی 100 میلی گرم در لیتر اینوسیتول و 2 گرم در لیتر عصاره مخمر منتقل می شود و در شرایط 0C37 و فتوپریود 16 ساعت با شدت نور Jm-2s-16 نگهداری می‌شود. بعد از 21 روز تعداد جنینهای تکامل یافته شمارش می شوند. و اگر جنین تشکیل نشده بود ابعاد اندامهای سبز نیمه ارگانیک یادداشت می شود.
در سال 1985 آقای می جر[19] و همکارانش (69) برای بررسی گیاهان یونجه دیپلوئید از 19 کالتیوار استفاده نمودند. تعداد ژنوتیپ های مورد استفاده در هر کالتیوار متفاوت و بین 5 تا 58 ژنوتیپ بود. برای ضدعفونی سطحی بدور یونجه از اتانول 70 درصد استفاده شد که به مدت 1 دقیق درون محلول قرار می گیرد. و بعد به مدت 10 دقیق در محلول 100 میلی‌لیتری Hgcl2 2/0 درصد که قطره ای از Tween80 دارد ضدعفونی می گردد. سپس 5 بار با آب مقطر شستشو می گردند. بذور ضدعفونی شده را در محیط کشت MS بدون مواد تنظیم کننده رشد و حاوی 2 درصد ساکارز و آگار 8/0 درصد کشت می دهند. تمام محیطهای کشت را در حرارت 0C121 به مدت 20 دقیق انکوباسیون می نمایند. PH محیط کشت قبل از اتوکلاو شدن 8/5 می باشد. بذور در تاریکی و در حرارت 0C25 جوانه زده وقتی هیپوکوتیل ها به طول تقریبی 5 سانتیمتر بعد از مدت 2-3 هفته رسید آنها را به شرایط فتوپریود 16 ساعته به مدت 2-3 روز منتقل می نمایند. هیپوکوتیل ها را به ابعاد 5 تا 8 میلی متری بریده کوتیلدونها را برداشته و ساقه ها در همان محیط در ظروف 10 سانتیمتری پلی کربناته کشت می دهند. به ازای هر گیاهک، 3 اکسیدانت روی یکی از دو محیط کشت القاء کالوس درون پتریدیش های 2×60 میلی متری پلاستیکی قرار گرفتند. پتری دیش ها توسط پارافیلم مسدود شده و کلیه کشت ها در شرایط 0C25 و در تناوب نوری 16 ساعته با شدت نور فلورسنت m mol m-2s-1 25 نگهداری شدند پروتکل های محیطهای کشت قراردادی برای جنین زائی سوماتیکی عبارتند از:
پروتکل I- برای القاء کالوس، 30 روز در محیط کشت UM حاوی 25/0 میلی گرم در لیتر کینتین و 2 میلی گرم در لیتر 2-4-D قرار می گرفتند و سپس برای تشکیل جنین به مدت 30 روز در محیط کشت MS حاوی 05/0 کیلی گرم در لیتر BA و 05/0 میلی گرم در لیتر NAA قرار می گرفتند.
پروتکل II- برای تنشکیل کالوس، 30 روز در محیط کشت B5h حاوی 2/0 میلی گرم در لیتر کینتین و 1 میلی گرم در لیتر 2-4-D و برای القاء جنین، 21 روز در محیط کشت SH حاوی 1 میلی گرم در ایتر کینتین و 11 میلی گرم در لیتر
2-4-D و در نهایت برای نمو و تکامل جنین ها در محیط کشت Boi2y قرار می گرفتند.
پروتکل مجدداً با اکسپلانت های پتیول از کشت ساقه کلیه ژنوتیپ های قابل باززائی و تعداید از ژنوتیپ های غیرقابل باززائی، تکرار شدند. در آزمایشاتی که از پتیول استفاده شده بود 3 تکرار و هر تکرار حاوی 5 پتیول 5 تا 8 میلی متری در هر پتریدیش استفاده گردید. جنین های سوماتیکی در محیط کشت SH را به آن 02/0 میلی گرم در لیتر 2ip و IAA اضافه گردیده بود و یا در محیط کشت MS پایه که به آن 2 درصد ساکارز اضافه شده بود کشت گردید.
دانلود مقاله کامل درباره اصلاح نباتات
