پروژه ساخت داربست های مهندسی بافت به روش ((Gas Foaming)). doc

اختصاصی از فی بوو پروژه ساخت داربست های مهندسی بافت به روش ((Gas Foaming)). doc دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

نوع فایل: word

قابل ویرایش 240 صفحه

مقدمه:

یکی از معضلات بزرگی که علم پزشکی از دیرباز با آن درگیر بوده است، ارائه درمانی قطعی برای بازسازی بافت های از کار افتاده و یا معیوب است. متداول ترین شیوه در درمان این نوع بافت ها، روش سنتی پیوند است که خود مشکلات عدیده ای را به دنبال دارد. از جمله این مشکلات می توان به کمبود عضو اهدائی، هزینه بالا و اثرات جانبی حاصل از پیوند بافت بیگانه Allograft)) که مهمترین آنها همان پس زنی بافت توسط بدن پذیرنده است اشاره کرد. این محدودیت ها دانشمندان را بر آن داشت تا راه حلی مناسب برای این معضل بیابند.

 مهندسی بافت با عمر حدوده 1 ساله خود روشی نوید بخش در تولید گزینه های بیولوژیکی برای کاشتنی ها (Implants) و پروتزها ارائه کرده و وعده بزرگ تهیه اندام های کاملاً عملیاتی برای رفع مشکل کمبود عضو اهدائی را می دهد. اهداف مهندسی بافت فراهم سازی اندام های کارآمد یا جایگزین های قسمتی از بافت برای بیمارانی با ضعف یا از کارافتادگی اندام و یا بیماری های حاد است که این امر با استفاده از روش‌های درمانی متنوع اندام مصنوعی- زیستی تحقق می یابد. بنا به تعریف، مهندسی بافت رشته ای است که از ترکیبعلم بیولوژی مواد و علم مهندسی یا به عبارتی Biotech جهت بیان ارتباطات ساختاری بافت های فیزیولوژیکی و طبیعی پستانداران در راستای توسعه روش های نوین ترمیم بافت و جایگزین سازی بافت، توسعه یافته است. مهندسی بافت شامل مباحثی نظیر ترکیبات نوین سلول ها، بیومواد غیرسلولی، داروها، فرآورده های ژنی یا ژن هایی می باشد که قابل طراحی، تشخیص و ساخت بوده و امکان رهایش آنها به طور همزمان یا ترتیبی به عنوان عامل های درمانی میسر باشد. اگرچه داروها یا بیومواد غیر سلولی به مواد بسیاری اطلاق می گردد اما درمان های منهدسی بافت در واقع منحصر به فرد هستند.

در مهندسی بافت، سلول ها بر روی یک بستر از جنس پلیمر زیست تخریب پذیر بسیار متخلخل استقرار یافته، رشد و تکثیر می یابند. روند رشد این سلول ها در جهت بازسازی بافت در سه بعد است. یکی از اساسی ترین قسمت های مهندسی بافت، داربست های زیست تخریب پذیر هستند که تحت نام Scaffold شناخته می شوند. این داربست ها در حقیقت بستری متخلخل با ساختاری شبیه به ماتریس برون سلولی بافت (ECM) هستند که رشد سلول را به سمت تشکیل بافت مورد نظر جهت می دهند. از آنجا کلیه سلول های بدن به غیر از سلول های سیستم خون رسانی و بافت های جنینی خاص بر روی ECM رشد می کنند، ایجاد یک بستر مصنوعی در محیط in vitro بسیار اهمیت دارد. با رشد سلول ها بر روی داربست، داربست تخریب می شود. جنس این داربست ها پلیمر و در بعضی موارد کامپوزیت پلیمر- سرامیک است.

پر استفاده ترین پلیمر ها در مهندسی بافت پلیمرهای خانواده پلی-هیدروکسی اسید شامل PGA , PLA و PLGA هستند که به طور گسترده به عنوان داربست مورد استفاده قرار می گیرند. داربست های کامپوزیت پلیمر-سرامیک در موارد ارتوپدی استفاده شده و از مهمترین سرامیک های به کار رفته در آنها می توان به تری کلسیم فسفات، تتراکلسیم فسفات و هیدورکسی آپاتیت اشاره کرد. علت به کارگیری سرامیک ها در داربست، افزایش استحکام پلیمر، چسبندگی به استخوان و قابلیت تحرک رشد درون استخوان است. بهینه ترین کامپوزیت در این مورد ترکیب PLGA و هیدروکسی آپاتیت شناخته می شود.

 مکانیزم تخریب PGA , PLA و کوپلیمر های آنها بر اساس هیدرولیز تصادفی باندهای استری زنجیره پلیمری است. محصول نهایی این تخریب آب و است که به آسانی از بدن دفع می شوند. یک داربست ایده آل بایددارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امکان پاکسازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مکانیکی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد. علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی (intracellular signaling) را به نحوی ارتقاء دهد که سلول ها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند. برای رشد سریع سلول، داربست باید دارای میکروساختار بهینه باشد، فاکتورهای مهم یک داربست عبارتند از اندازه خلل و فرج، شکل و مساحت ویژه سطح. خلل و فرج موجود در داربست در حقیقت مسیرهای غذارسانی سلول ها و دفع پسماندهای سلولی هستند. برای مثال خلل و فرج بهینه برای رشد سلولهای فیبروبلاست درون رست، خلل و فرج مناسب برای بازسازی پوست یک پستاندار بالغ30-350, 20-125برای بازسازی استخوان است. بنابراین هدف اصلی در ساخت داربست، کنترل دقیق اندازه خلل و فرج و تخلخل است. مورد دیگر نحوه ایجاد چسبندگی مناسب سلول به سطح داربست است که در این مورد هم شیوه های متفاوتی به کار برده می شود، یکی از ساده ترین شیوه ها به کارگیری رشته های کوچک پپتیدی در پروتئین های ECM است که به عنوان واسطه مسئولیت چسبندگی سلول به بیومواد را بر عهده دارند. اجزاء گوناگون سرم قابل حل (پروتئین ها، پپتیدها) و رشته RGD برای تسهیل چسبندگی سلول شناخته شده اند.

از آنجا که ECM بافت های مختلف باهم تفاوت دارد، داربست های مصنوعی به کار رفته برای هر بافت نیز با هم فرق می‌کند. تهیه داربست هایی با ماتریس های مختلف نیازمند به کارگیری روش های ساخت متفاوتی است که هر یک شیوه و کاربرد منحصر به خود را دارد. از جمله این روش ها می توان به Melt Casting , Freeze Drying , Membrane Lamination , Solvent Casting Gas Foaming , Polymerization, Phase Separationاشاره کرد.

قالب گیری حلال (Solvent Casting)‍: قالب گیری حلال یک روش ساده برای تولید داربست مهندسی بافت است. در این روش پلیمر در یک حلال مناسب حل شده و در قالب ریخته می شود. سپس حلال حذف گردیده و حالت پلیمر را در شکل مورد نظر حفظ می‌کند. این شیوه به شکل های قابل حصول محدود می شود. غالباً تنها طرح های قابل شکل‌گیری در این روش صفحات صاف و لوله ها هستند. البته با قراردادن صفحات صاف روی هم نیز می توان به اشکال پیچیده تر دست یافت. در این شیوه می توان با شستن ذراتی مانند کریستال های نمک کاشته شده درون پلیمر که Progen خوانده می شود، داربست را به صورت متخلخل درآورد. مزیت اصلی قالب گیری حلال سادگی ساخت بدون احتیاج به تجهیزات خاص است. همچنین از آنجا که عمل ساخت در دمای اتاق انجام می گیرد نرخ تخریب پلیمر زیست تخریب پذیر به روش قالب گیری حلال کمتر از فیلم های قالب گرفته شده از طریق تراکم خواهد بود. عیب اصلی قالب گیری حلال باقی ماندن احتمالی حلال سمی درون پلیمر است. برای رفع این عیب باید به پلیمر اجازه داد تا کاملاً خشک شده و سپس با استفاده از خلاء حلال باقی مانده را خارج نمود. عیب دیگر این روش احتمال تغییر یافتن ماهیت پروتئین و دیگر مولکول های موجود در پلیمر به واسطه استفاده از حلال است.

لایه سازی غشاء (Membrane Lamination): لایه سازی غشاء روش های درمانی از طریق سلول های کپسوله شده برای رهایش گسترده ای از محصولات به دست آمده از مولکول های کوچک (برای مثال، دوپامین، انکفالین ها) تا محصولاتی با ژن های بسیار بزرگ (مانند فاکتورهای رشد، ایمیونوگلوبولین ها) را در بر می گیرد. رهایش مواد فعال در مناطق خاصی از بدن به طور سنتی توسط کپسول های پلیمری تخریب پذیر و غیر تخریب پذیر که حاوی یک یا چند دارو هستند احاطه شده است. در این حوزه مواد در حین ساخت با یک ماتریس پلیمری ترکیب شده و سپس بعد از مدت زمانی مشخص از میان ماده (diffusion) و یا در خلال تخریب ماده (erusion) آزاد می شوند. در این جا کنترل مناسب کنتیک های آزاد شده از اهمیت خاصی برخوردار است. یک مثال در این مورد کنتیک های رها شده مرتبه صفر به دست آمده از میله های کوپلیمر استات اتیلن- ونیل (EVAc) به کار رفته در رهایش عامل های شیمی درمانی در مغز است. در طول دو دهه اخیر محققان تلاش کرده اند که مواد را از ناقل های رهایش هیبریدی زیست مصنوعی (bioartificial) که شامل لایه های غشا بر سطح اجزاء سلولی کپسوله شده که درون غشا هستند آزاد کنند. کاربرد و هدف اصلی سلول های کپسوله شده، درمان دردهای مزمن بیماری پارکینسون و دیابت نوع I، همچنین ناتوانی های دیگر ناشی از افت ترشح عملکرد سلول است که با کاشت اندام یا درمان های دارویی به طورکامل قابل مداوا نیستند. کپسوله کردن بافت عموما به دو شکل انجام می گیرد: لایه بندی غشا میکروکپسوله و ماکرو متخلخل در میکرو کپسوله سازی یک یا چند سلول با پراکندگی‌های کروی فراوان (با قطر 100-300 nm) کپسوله می شوند. در ماکرو کپسوله سازی تعداد زیادی از سلول ها یا توده های سلولی در یک یا چند کپسول نسبتاً بزرگ کاشته می شوند. مزیت روش دوم، پایداری شیمیایی و مکانیکی و سادگی بازیافت در صورت نیاز است. اولین دستگاهی که به این روش تأئیدیه ایالت متحده را کسب کرده است دستگاهی به نام کبدیار (Liver assist)

انجماد- خشک سازی (Freeze- Drying): این شیوه برای تولید داربست های PLG بسیار متخلخل با مزیت قابلیت تلفیق رشد پایه پروتئینی و فاکتورهای تفاضلی در زمان پردازش، معرفی شده است. این شیوه قادر به ایجاد داربست هایی با تخلخل بیشتر از 90% و کنترل خلاء و فرج هایی به اندازه 20- 200 است. این روش پردازش شامل ایجاد یک امولسیون از طریق هموژنیزه کردن محلول پلیمر- حلال و آب، سرد کردن سریع امولسیون جهت حفظ ساختار حالت مایع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشک سازی است.

در این فرایند، در ابتدا دو محلول مخلوط شدنی فاز آب و یک فاز آلی را تشکیل می دهند. فاز آلی توسط حل شدن PLG با ویسکوزیته ذاتی ویژهدر MC ایجاد می شود. فاکتورهای زیست فعال و عوامل فعال را می توان در این فاز حل کرد. فاز آب از آب فوق خالص به همراه آب یا بدون افزودنی های حل شدنی مختلف مانند فاکتورهای زیست فعال هیدروفیل تشکیل شده است. سپس فاز آلی و آب در یک لوله آزمایش شیشه ای که 40% حجم آن آب است به هم اضافه شده و دو لایه نامخلوط را شکل می‌دهند. این لایه های نامخلوط به وسیله یک همگن ساز دستی که در سرعت های مختلف نتظیم می شود همگن شده و در یک قالب مناسب (برای مثال، شیشه یا مس) ریخته می شود سپس با گذاشتن سریع قالب بر روی بلوک مس در کنار نیتروژن مایع با دمای (~ -1960C) سرد می شود. نمونه های فوق در یک دستگاه انجماد- خشک سازی سفارشی 20 motorr و دمای آغازین –1100C منجمد و خشک می شوند. بعد از اینکه دمای داخل امولسیون برای یک ساعت در –1100C به تعادل رسید، دستگاه تراکم ساز خاموش شده و دستگاه متراکم ساز و امولسیون به آرامی در طی 12h تا دمای اطاق گرم می شوند. نمونه های به دست آمده در یک دستگاه خشک ساز خلا در دمای اتاق برای ذخیره سازی و حذف بیشتر هر گونه حلال باقیمانده قرارداده می شوند.

جداسازی فاز (Phase Separation): این روش بر اساس جداسازی فاز مایع- جامد در محلول پلیمر در اثر بلورینگی حلال عمل می‌کند. اسفنج به دست آمده در اثر فرآیند جداسازی فازمایع- جامد دارای مورفولوژی لوله ای شکل ناهمگون با یک ساختار نردبانی شکل داخلی است. اسفنج فوق با شبکه ای از خلل و فرج های پیوسته توسط القای گرمایی جداسازی فاز مایع- مایع ایجاد می شود. ماتریس رشته ای مصنوعی با فیبرهایی با قطری به مقیاس نانومتر توسط فرآیند ژل سازی به وسیله القای گرمایی تهیه می شوند. ماتریس های نانو رشته ای با ساختار ماکرومتخلخل به وسیله ترکیب روش پالایش پروژن و فرآیند ژل سازی به وسیله القای گرمایی به دست می آیند. اسفنج های متخلخل پلیمرهای زیست تخریب پذیر و آپاتیت های استخوانی معدنی شکل توسط فرآیند جداسازی فاز مایع- جامد و فرآیند زیست تقلیدی تهیه می شوند. جداسازی فاز محلول پلیمر را می توان به چندین روش ایجاد کرد، که شامل جداسازی از طریق غیر حلال، جداسازی فاز از طریق شیمیایی و جداسازی فاز از طریق گرمایی (TIPS) می شود. در فرایندTIPSکه یک روش نسبتاً جدید برای تهیه غشاهای متخلخل است، دمای محلول پلیمر کاهش یافته و جداسازی فاز رخ می دهد که فاز اول آن غنی از پلیمر و فاز دوم فقیر از پلیمر است. بعد از خارج سازی حلال از طریق عصاره گیری، تبخیر یا تصعید، پلیمر موجود در فاز غنی از پلیمر به شکل اسکلت سخت شده و فضاهای اشغال شده توسط حلال در فاز عاری از پلیمر به صورت خلل و فرج اسفنج پلیمر در می آیند. غشاهای به دست آمده از این فرایند معمولاً دارای خلل و فرجی با قطر چندین میکرومتر بوده و معمولاً برای داربست های مهندسی بافت مناسب نیستند.

بسپارش (Ploymerization): داربست های به دست آمده از طریق روش بسپارش کاندیدهای خوبی برای مهندسی بافت به شمار رفته و به دلیل سهولت ساخت نسبت به روش های دیگر ساخت داربست ارجحیت دارند. با وجودیکه پلیمرهای متخلخلی را می توان به این روش بسپارش کرد اما تعداد کمی از آنها منجر به داربست های متخلخل می شوند. در این روش ترکیب منومر در حضور حلالی که منومر در آن قابل حل ولی پلیمر غیر قابل حل است،درون قالب بسپارش می شود. گذار حلالیت در خلال بسپارش منجر به دو فاز می گردد، ساختار زیستی پیوسته پلیمر و حلال. بدین ترتیب داربست تولیده شده در نتیجه بسپارش برای ایجاد خلل و فرج های درهم نیازی به پالایش پروژن ندارند. اسفنج ها یا داربست های PHEMA ساخته شده به این روش دارای قابلیت دخول سلول بوده و حلال مازاد آنها معمولاً آب است. اسفنج های PHEMAبه منظور افزایش حجم پستان و جایگزینی غضروف بینی نگهدارنده بین بافت قرنیه و هسته مرکزی و جایگزین بافت های نرم به کار برده می شوند. یکی از معایب این اسفنج‌ها، آهکی شدن آنها پس از مرور زمان است. این اسفنج ها قابلیت تحمل اتوکلاو را داشته و به سادگی به اشکال مختلف تغییر فرم می دهند.

اسفنج سازی گازی (Gas Foaming): روش اسفنج سازی گازی به دلیل قابلیت تخلخل پذیری بالا بدون به کارگیری دمای بالا یا حلال آلی حائز اهمیت است. با حذف دمای بالا و حلال آلی می توان مولکول های زیست فعال بزرگ شامل فاکتورهای رشد را با حفظ فعالیت زیستی در پلیمر مجتمع ساخت. پلیمری که در این روش پردازش می شود PLGA است. در این روش گرانول های PLGA و پروژن که معمولاً کلرید سدیم است در یک کانتینر با فشار بالا (در حدود 5.5 Mpa) با CO2به مدت 24h به تعادل می رسند. در این مدت گاز CO2 در پلیمر که اکنون در تعادل ترمودینامیکی به حالت سیال در آمده است حل می شود. سپس فشار را به سرعت کاهش می دهند. افت سریع فشار سبب به هم خوردن تعادل ترمودینامیکی و در نتیجه تشکیل هسته حباب های CO2 در پلیمر می گردد. پلیمر که پس ازکاهش فشار تمایل به رسیدن به حالت جامد دارد به شکل اسفنج منبسط میشود. ذرات پلیمری منفرد در اطراف ذرات پروژن منبسط شده و پس از پالایش پروژن فوق یک داربست بسیار متخلخل با خلل و فرج های باز کنترل شده به دست می آید. از جمله مزایای این روش کنترل اندازه خلل و فرج و قابلیت ایجاد داربست های بزرگ، عدم استفاده از حلال آلی و دمای بالا را می توان نام برد.

طرح بسیار ساده ای از فرآیند مهندسی بافت بدین صورت است کهبافت از طریق biopsy خارج می گردد. بافت فوق می‏تواند Autograft (بافت خود فرد) یا Allograft (بافت فرد دیگر) یا Xenograft (بافت گونه دیگر) باشد. بافت به دست آمده در این مرحله همانند بانک خون وارد قرنطینه شده و از جنبه‏های مختلف بیماری زایی مانند وجود ویروس HIV یا هپاتیت C,B، و تغییرات بردارهای ژنی مورد بررسی قرار می گیرند. بافت ها تا زمان تعیین ایمنی نهایی در قرنطینه و شرایط سرد نگهداری می شوند.

مرحله بعد شامل تست های ایمنی است که شامل آزمون بافت از نظر Sterility در محیط تیوگلیکولات یا مواد تصویب شده دیگر،تعیین سمیت توسط آزمایش LAL و تست میکوپلاسما توسط کشت مستقیم در محیط Sentry Cell Culture می‌شود.

پس از مراحل فوق پردازش بافت که شامل دو قسمت گزینش و جداسازی سلول از بافت است شروع می گردد. در مرحله جداسازی، سلول‏ها از طرق مختلف از بافت جدا می‏شوند. این طرق شامل روش‏های برون کاشت، آنزیمی، مکانیکی، تجزیه شیمیایی، تزریقی و ترکیبی می‌شود. گزینش سلولی بر اساس خاصیت منحصر به فردی که یک سلول را از دیگری متمایز می کند مانند چگالی، اندازه، نشانه گذاری، گذرگاههای منحصر به فرد متابولیکی و احتیاجات غذایی صورت می گیرد.

سلولهای بدست آمده بر روی داربست کاشته شده و در محیط کشت سلولی که شامل مخلوطی از مواد غذایی ضروری (نمک‏ها، آمینو اسیدها، ویتامین‏ها، کربوهیدرات‏ها، اسیدهای چرب)، بافرها (تثبیت کننده‏ها) و عناصر ردیابی بصورت مکمل فاکتورهای میتوژنیک مشتق شده از حیوان، هورمون‏های مصنوعی و فاکتورهای رشد می باشد قرار می گیرد. انواع خاصی از سلولهای برای تکثیر نیازمند هم کشتی با سلولهای feeder هستند.

سلولها برای مدتی معین بر روی داربست کشت یافته و سپس در محل آناتومیکی مورد نظر Transplant می شوند.

فهرست مطالب:

پیشگفتار

نتایج قانونمند و استاندارد شده

گزینش و جداسازی سلول

تولید داربست‏های پلیمری: قالب گیری حلال

تولید داربست‏های پلیمری: لایه سازی غشاء

تولید داربست‏های پلیمری: انجماد - خشک سازی

تولید داربست‏های پلیمری: اشکال کامپوزیت پلیمر- سرامیک

تولید داربست‏های پلیمری: جداسازی فاز

تولید داربست‏های پلیمری: پلیمریزاسیون (بسپارش)

تولید داربست‏های پلیمری: پردازش اسفنج گازی

بر هم کنش‏های سلولی سطح مصنوعی: بیومواد خود مجتمع

بر هم کنش‏های سلولی سطح مصنوعی: چسبندگی سلول هدف